Introducción
La rabia es una enfermedad viral aguda que puede afectar a todos los animales de sangre caliente. La seropositividad es una indicación de contacto previo con el virus. Luego de brotes de rabia en ganado, se observan altos títulos de anticuerpos en vampiros. La ausencia de respuesta inmune puede ser interpretada como un indicador de susceptibilidad, y por lo tanto como un indicador de riesgo. Las técnicas serológicas son asimismo útiles para controlar la respuesta inmune a la vacunación en animales domésticos.
El RFFIT es una técnica serológica que no requiere de reactivos específicos para cada especie, y puede ser utilizada por lo tanto, para detectar anticuerpos antirrábicos en cualquier especie utilizando el mismo diseño experimental.
Materiales y Métodos
1- Línea celular. Se utilizó un cultivo de células BHK en monocapa. Se realizaron subcultivos cada 48 horas, utilizando un Medio mínimo suplementado con glucosa (4.5g/l) y suero fetal bovino al 10%.
2- Cepa viral. Se realizó una modificación de la técnica original y se empleó la cepa Pasteur (PV). En este laboratorio la cepa PV es utilizada para producción del antígeno vacunal cultivada en células BHK en suspensión, por lo que la cepa está bien adaptada a esa línea celular.
3- Sueros control. Sueros de cobayos vacunados y vírgenes se utilizaron como control positivo y negativo respectivamente.
4- Sueros de campo. Fueron obtenidos mediante punción cardíaca bajo anestesia. La extracción se realizó mediante centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos. Las diluciones se realizaron en Médio mínimo suplementado con glucosa.
5- Especies testadas. Eumops bonariensis, Molossus molossus, Tadarida brasiliensis, Eptesicus furinalis, Myotis albescens, Desmodus rotundus, Cerdocyon thous.
6- Tinción e interpretación de los resultados. Se utilizó un anticuerpo antirrábico conjugado con FITC (VMRD) para la tinción. Se observaron 20 campos al azar bajo microscopio en cada pocillo, y fueron clasificados como positivos o negativos. El título se calculó como el inverso de la dilución que presentó el 50% de los campos negativos.
Resultados
La exanguinación mediante punción cardiaca bajo anestesia, probó ser un método eficiente para la obtención de volúmenes de sangre aceptables incluso en animales con un peso corporal menor a 5 gramos. Las muestras de sangre fueron transportadas desde el campo en frío y fueron centrifugadas en el laboratorio. Los sueros de control positivo mostraron inhibición completa de la infección en la dilución 1:10 y ~50% de inhibición en la dilución 1:20. No se observaron efectos citotóxicos importantes en las diluciones de suero 1:5. Cinco ejemplares representando dos especies mostraron títulos mayoes a 1:5, sugiriendo una respuesta inmune inducida por exposición al virus.
Conclusiones
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El protocolo modificado de RFFIT probó ser eficiente en la detección de respuesta inmune de diferentes especies.
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Las modificaciones realizadas a la técnica permitieron su aplicación en un laboratorio local.
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Se consiguió la producción de sueros control a nivel local.
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El bajo costo y la velocidad hacen a esta técnica altamente adecuada para investigaciones serológicas amplias en fauna silvestre.
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El RFFIT es igualmente adecuado para el seguimiento de la vacunación en animales domésticos y ganado.
Perspectivas
Los sueros control deberán ser titulados contra un suero estándar internacional. Por el momento los resultados obtenidos son cualitativos. Investigaciones poblacionales en murciélagos y fauna silvestre deberán ser realizadas en apoyo a los programas nacionales de vigilancia de rabia.
La rabia es una enfermedad viral que puede afectar a todas las especies de mamíferos. A nivel regional y mundial, los reservorios silvestres adquieren mayor importancia, conforme los ciclos urbanos son controlados y aumenta el impacto de actividades humanas sobre los ambientes naturales. La vigilancia epidemiológica es una herramienta importante para el control de la enfermedad. Entre las técnicas laboratoriales, la serología es un instrumento adecuado para la investigación epidemiológica especialmente en fauna silvestre.
En Uruguay, un brote de rabia comenzó a fines de 2007, luego de más de 20 años de considerarse un país libre de la enfermedad. La vigilancia de la rabia desde el comienzo del brote se ha basado principalmente en ensayos de inmunofluorescencia directa en muestras de tejido nervioso de Desmodus rotundus y ganado. Este tabajo consistió en la puesta a punto de una técnica serológica cualitativa (modificación del RFFIT) para vigilancia de circulación viral en fauna silvestre. La técnica original fue alterada para adaptarla a un laboratorio local, cambiando la cepa viral y la línea celular. Se utilizó la cepa PV cultivada en células BHK en suspensión como inóculo. La técnica se desarrolló sobre cultivos de BHK en monocapa. Como controles se utilizaron sueros de cobayo (Cavia porcellus).
El suero de un ejemplar vacunado con tres dosis subcutáneas se utilizó como control positivo y el suero de un ejemplar sin exposición previa, como control negativo. El suero del cobayo vacunado mostró buena capacidad para inhibir la infección, mientras que el suero del cobayo virgen no mostró inhibición. Un bajo título (1:5) se estableció como valor de corte para descartar fácilmente las muestras negativas. La técnica tal como se desarrolló en este trabajo es una herramienta útil para la vigilancia epidemiológica. Las modificaciones realizadas sobre la técnica original probaron ser eficientes en la detección de respuesta inmune humoral a la exposición a rabia. Los sueros utilizados como control deberán ser testados y titulados contra un suero de referencia internacional. Resultados preliminares de sueros de fauna silvestre revelaron la presencia de anticuerpos en tres muestras de suero de D. rotundus colectadas durante el brote.
(1) GIM, Grupo de Investigación y Conservación de los Murciélagos de Uruguay. Museo Nacional de Historia Natural y Antropología. (2) Sector Virología, Laboratorios Santa Elena S.A. (3) Sección Virología. Facultad de Ciencias, Universidad de la República. e-mail: germanbotto@gmail.com